Γενετική μηχανική ανασυνδυασμένου DNA

Απομόνωση του κλώνου

Γενικά, η κλωνοποίηση πραγματοποιείται προκειμένου να ληφθεί ο κλώνος ενός συγκεκριμένου γονιδίου ή αλληλουχίας DNA που ενδιαφέρει. Το επόμενο βήμα μετά την κλωνοποίηση, επομένως, είναι η εύρεση και η απομόνωση αυτού του κλώνου μεταξύ άλλων μελών της βιβλιοθήκης. Εάν η βιβλιοθήκη περιλαμβάνει ολόκληρο το γονιδίωμα ενός οργανισμού, τότε κάπου μέσα στη βιβλιοθήκη θα είναι ο επιθυμητός κλώνος. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι εύρεσης, ανάλογα με το συγκεκριμένο γονίδιο. Συνήθως, ένα κλωνοποιημένο τμήμα DNA που δείχνει ομολογία με το γονίδιο που αναζητήθηκε χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής. Για παράδειγμα, εάν ένα γονίδιο ποντικού έχει ήδη κλωνοποιηθεί, τότε αυτός ο κλώνος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εύρεση του ισοδύναμου ανθρώπινου κλώνου από μια ανθρώπινη γονιδιωματική βιβλιοθήκη. Οι βακτηριακές αποικίες που αποτελούν βιβλιοθήκη αναπτύσσονται σε μια συλλογή από πιάτα Petri. Στη συνέχεια, μια πορώδης μεμβράνη τοποθετείται πάνω από την επιφάνεια κάθε πλάκας και τα κύτταρα προσκολλώνται στη μεμβράνη. Τα κύτταρα διαρρηγνύονται και το DNA διαχωρίζεται σε μονόκλωνα - όλα στη μεμβράνη. Ο ανιχνευτής διαχωρίζεται επίσης σε μονόκλωνα και επισημαίνεται, συχνά με ραδιενεργό φωσφόρο. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται διάλυμα του ραδιενεργού ανιχνευτή για το λούσιμο της μεμβράνης. Το μονόκλωνο DNA ανιχνευτή θα προσκολλάται μόνο στο DNA του κλώνου που περιέχει το ισοδύναμο γονίδιο. Η μεμβράνη ξηραίνεται και τοποθετείται πάνω σε ένα φύλλο φιλμ ευαίσθητο στην ακτινοβολία, και κάπου πάνω στις μεμβράνες θα εμφανιστεί μια μαύρη κηλίδα, ανακοινώνοντας την παρουσία και τη θέση του επιθυμητού κλώνου. Ο κλώνος μπορεί στη συνέχεια να ανακτηθεί από τα αρχικά πιάτα Petri.

γενετική: Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Οι τεχνικές εξελίξεις έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο της γενετικής κατανόησης. Το 1970 οι Αμερικανοί μικροβιολόγοι Ντάνιελ Νάτανς

.

Αλληλουχία DNA

Μόλις κλωνοποιηθεί ένα τμήμα DNA, μπορεί να προσδιοριστεί η νουκλεοτιδική αλληλουχία του. Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων είναι το πιο θεμελιώδες επίπεδο γνώσης ενός γονιδίου ή γονιδιώματος. Είναι το προσχέδιο που περιέχει τις οδηγίες για την οικοδόμηση ενός οργανισμού και καμία κατανόηση της γενετικής λειτουργίας ή της εξέλιξης δεν θα μπορούσε να είναι πλήρης χωρίς τη λήψη αυτών των πληροφοριών.

Χρήσεις

Η γνώση της ακολουθίας ενός τμήματος DNA έχει πολλές χρήσεις και ακολουθούν ορισμένα παραδείγματα. Πρώτον, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εύρεση γονιδίων, τμημάτων DNA που κωδικοποιούν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη ή φαινότυπο. Εάν μια περιοχή DNA έχει προσδιοριστεί αλληλουχία, μπορεί να ελεγχθεί για χαρακτηριστικά χαρακτηριστικά των γονιδίων. Για παράδειγμα, ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) - μακρές αλληλουχίες που ξεκινούν με ένα κωδικόνιο έναρξης (τρία γειτονικά νουκλεοτίδια · η αλληλουχία ενός κωδικονίου υπαγορεύει την παραγωγή αμινοξέων) και δεν διακόπτονται από κωδικόνια διακοπής (εκτός από ένα στο τέλος τους) - προτείνει ένα περιοχή κωδικοποίησης πρωτεΐνης. Επίσης, τα ανθρώπινα γονίδια είναι γενικά γειτονικά με τα λεγόμενα νησιά CpG - συστάδες κυτοσίνης και γουανίνης, δύο από τα νουκλεοτίδια που αποτελούν το DNA. Εάν ένα γονίδιο με ένα γνωστό φαινότυπο (όπως ένα γονίδιο νόσου σε ανθρώπους) είναι γνωστό ότι βρίσκεται στην χρωμοσωμική περιοχή που προσδιορίζεται με αλληλουχία, τότε μη εκχωρημένα γονίδια στην περιοχή θα γίνουν υποψήφια για αυτήν τη λειτουργία. Δεύτερον, μπορούν να συγκριθούν ομόλογες αλληλουχίες DNA διαφορετικών οργανισμών προκειμένου να σχεδιαστούν εξελικτικές σχέσεις τόσο εντός όσο και μεταξύ ειδών. Τρίτον, μια αλληλουχία γονιδίων μπορεί να ελεγχθεί για λειτουργικές περιοχές. Προκειμένου να προσδιοριστεί η λειτουργία ενός γονιδίου, μπορούν να αναγνωριστούν διάφοροι τομείς που είναι κοινές σε πρωτεΐνες παρόμοιας λειτουργίας. Για παράδειγμα, ορισμένες αλληλουχίες αμινοξέων εντός ενός γονιδίου βρίσκονται πάντα σε πρωτεΐνες που καλύπτουν μια κυτταρική μεμβράνη. Τέτοιες εκτάσεις αμινοξέων ονομάζονται διαμεμβρανικές περιοχές. Εάν μια διαμεμβρανική περιοχή βρίσκεται σε ένα γονίδιο άγνωστης λειτουργίας, υποδηλώνει ότι η κωδικοποιημένη πρωτεΐνη βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη. Άλλοι τομείς χαρακτηρίζουν πρωτεΐνες που δεσμεύουν DNA. Αρκετές δημόσιες βάσεις δεδομένων ακολουθιών DNA είναι διαθέσιμες για ανάλυση από οποιοδήποτε ενδιαφερόμενο άτομο.